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Carolina Carrillo, parte del equipo de desarrollo, cuenta cómo funciona el test rápido para coronavirus

Oriunda de Mar del Plata, y radicada en Buenos Aires, la doctora en Ciencias Químicas e investigadora independiente del CONICET forma parte del grupo del Instituto Milstein que creó el “NEOKIT-COVID-19”. Es un test sensible y de bajo costo que detecta el SARS-CoV-2 en muestras de ARN, y obtiene resultados en menos de dos horas.

 

Por Agustín Casa / @Agustin_Casa

 

En los últimos días, la ciencia argentina volvió a ser portada de diarios y portales de noticias del país. En esta ocasión, por la presentación del “NEOKIT-COVID-19”, un test de base molecular sensible, rápido y económico, desarrollado por científicas y científicos argentinos, que detecta el SARS-CoV-2 en muestras de ARN. Se trata de un test sencillo de operar, que permite obtener resultados en menos de dos horas, y que brindaría facilidades para la descentralización de testeos.

Las muestras clínicas se toman mediante hisopado naso y bucofaríngeo (al igual que para la técnica RT-PCR) y se validan en saliva y esputo. El test fue autorizado por la ANMAT para su uso como kit de diagnóstico luego de la validación clínica hecha a partir de muestras del ANLIS Malbrán.

La investigación la llevó adelante un equipo del Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César Milstein, un organismo público-privado perteneciente a CONICET y la Fundación Pablo Cassará. Del proyecto participó la marplatense Carolina Carrillo, quien estuvo presente en la residencia presidencial de Olivos durante el anuncio realizado por el presidente Alberto Fernández junto al ministro de Ciencia, Tecnología e Innovación, Roberto Salvarezza, el de Salud, Ginés González García, la presidenta del CONICET, Ana Franchi, y Adrián Vojnov, director del proyecto. Tanto Carrillo como Vojnov estuvieron en representación del equipo que desarrolló el kit, integrado también por Luciana Larocca, Fabiana Stolowicz, y Santiago Werbajh.

El NEOKIT-COVID-19 fue desarrollado por un equipo del Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César Milstein. Foto: MINCYT.

Carolina Carrillo es doctora en Ciencias Químicas (orientación Biología Molecular y Bioquímica) por la UBA. Previamente estudió la licenciatura en Ciencias Biológicas en la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad Nacional de Mar del Plata. Es investigadora independiente del CONICET y docente del Departamento de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la UBA.

Su trabajo en el laboratorio del Instituto Milstein está centrado en el Trypanosoma cruzi, el agente causal de la enfermedad de Chagas, y otros tripanosomátidos. Junto a su grupo ha desarrollado un kit de diagnóstico molecular para Chagas congénito. “El prototipo recibió el Premio INNOVAR 2013. Después pudimos ajustarlo y fue el primer kit de biología molecular argentino aprobado por ANMAT. Esto ocurrió en diciembre de 2017”, recuerda. Tanto en su laboratorio como en el de Adrián Vojnov se realizan proyectos de ciencia básica, de ciencia aplicada y de transferencia científico-tecnológica.

En diálogo con Citecus, Carrillo describió cómo desarrollaron el kit, sus principales características, sus diferencias con la técnica de detección por RT-PCR y su valoración sobre la divulgación científica.

-¿Cómo fue el proceso de desarrollo del NEOKIT-COVID-19?

-Para enero y febrero, a Santiago Werbajh, uno de los investigadores del equipo, se le ocurrió hacer análisis de secuencias de los genomas de SARS-CoV-2 que ya estaban descifrados. Cuando empezó a ser un problema más cercano, surgió la idea de realizar los primers o cebadores, que son unas secuencias específicas del genoma que sirven como anzuelo para pescar a la secuencia del propio virus de modo específico. Si tenemos genomas del virus y otros genomas, por ejemplo si tomamos una muestra de un paciente, vamos a tener contaminantes, el propio ADN de las células humanas, podemos tener alguna célula bacteriana, o un hongo. Y además esa persona puede tener SARS-CoV-2 o algún virus parecido. Los anzuelitos que llamamos primers son los que hacen que de todos los genomas que puedan estar en una muestra, solamente se identifiquen los que son específicos del SARS-CoV-2. Son como varios anzuelitos que funcionan en equipo. Santiago diseñó los primers y ya los habíamos mandado a comprar cuando acá se declaró la emergencia por COVID-19 y convocaron desde el Ministerio de Ciencia a los grupos que tenían experiencia en distintas cosas que podían servir para esta emergencia, entre ellos a los grupos que tenían experiencia en desarrollar kits de diagnóstico. Nosotros ya teníamos tiempo ganado gracias a la visión de Santiago, pero además teníamos mucha experiencia ganada porque en el 2011 comenzamos a trabajar con este mismo criterio para desarrollar el kit de diagnóstico de Chagas. Cuando empezamos a progresar con ese diseño, nos dimos cuenta que la herramienta que estábamos aplicando era muy poderosa y muy transferible a otras experiencias. Entonces, lo planteamos en términos de plataforma tecnológica para el desarrollo de kits. Esta experiencia de aprender a cómo adaptar la muestra, cómo hacer la reacción propiamente dicha de amplificación para detectar la presencia de los ácidos nucleicos, y cómo simplificar el tipo de lectura, hicieron que pudiéramos ir replicando esto para distintos patógenos. En el 2016, Santiago hizo el kit de diagnóstico para dengue, zika y chikungunya y esto también fue una experiencia súper valiosa para el momento de hacer la traslación de nuestra experiencia para COVID-19. Porque el SARS-CoV-2 es un virus cuyo material genético, que es lo que detecta el kit, es una molécula llamada ARN. Y el material genético de virus de dengue también es un ARN. Por lo cual, ya teníamos también ganados algunos pasos de adaptación, porque cuando las moléculas son de ARN hay que hacer primero una copia a un ADN copia y después se puede hacer la amplificación. Entonces, estas experiencias previas, en general de la plataforma, y en particular de poder lograr un kit con genomas virales de ARN, fueron las que permitieron también una rápida respuesta.

Contamos con el apoyo invalorable del Ministerio de Ciencia, que nos dio estructura y financiamiento para poder comprar reactivos para avanzar con las pruebas, y con el apoyo del Ministerio de Salud, que a través de ellos se pudo hacer la validación clínica con las muestras del ANLIS Malbrán.

¿Cómo funcionan estos test rápidos que detectan la presencia de SARS-CoV-2 en muestras de ARN? ¿Cuáles son sus características?

-Es un kit molecular, o sea, identifica el genoma. Es simplificado porque es muy fácil de hacer. Es rápido porque en una hora tenés un resultado. En general, hemos escuchado hablar así de los tests serológicos, que detectan anticuerpos. Éste es un test que es rápido y molecular. Es rápido como los serológicos, pero molecular, sensible y específico, y detecta la presencia del virus en el momento en que se toma la muestra como los moleculares convencionales, que son los PCR. En este sentido, la operatoria del kit es muy simple porque lo que se necesita es tener el ARN puro. Para tener el ARN puro se tiene que usar un kit que es independiente al nuestro, que también se usa para la PCR. A partir del hisopado, se procesa la muestra para romper todas las partículas virales y para extraer lo mejor posible el ARN del virus versus todo el material de la muestra y las cápsides de virus. Se busca quedarse sólo con el ARN. Ese proceso tiene que ser bajo normas de bioseguridad porque el virus es infectivo. Ese proceso toma alrededor de una hora y se hace con kits comerciales. Esa parte sigue siendo, por ahora, igual que para la PCR. Una vez que se tiene el ARN purificado o extraído, ahí sí aplicamos el NEOKIT. Los pasos son muy simples. El kit viene con tubitos de reacción ya preparados. Allí se coloca una gota de un reactivo que viene en el kit con un dispensador muy sencillo tipo gotero. Después se coloca un pequeño volumen de la muestra que se quiere evaluar, se tapa el tubo y eso toma una coloración violeta. Se pone en un calentador. Otra de las ventajas del kit es que sólo requiere un dispositivo térmico simple, que caliente a 64 °C en forma estable, a diferencia de la PCR que necesita un equipamiento muy costoso. Entonces, se incuba una hora y terminada la reacción, se mira el color del tubo. La lectura es súper simple. Si la reacción sigue color lila o violeta, la reacción es negativa. Es decir, no hay virus. En cambio, si la solución de la reacción pasa a color azul, la reacción es positiva. Eso quiere decir que hay genoma del virus y que esa persona tiene la infección.

El color de la reacción determina el resultado del test. Si se mantiene violeta o lila, no se detectó el virus. Si pasa a color azul, la persona está infectada. Foto: MINCYT.

-¿Cómo funciona la técnica la detección mediante Ampliación Molecular Isotérmica (AMI)? ¿Qué la diferencia de la RT-PCR? 

-El fundamento de esta Amplificación Molecular Isotérmica fue descrito en el año 2000 por unos japoneses. Ellos lo llamaron LAMP. Es parecido a la PCR. Para hacer la técnica PCR se necesita un aparato grande y costoso que va haciendo ciclos de cambio de temperatura. Porque se tiene una enzima polimerasa, que es la que es capaz de copiar las cadenas de ADN, pero la polimerasa necesita poder meterse adentro de la molécula de ADN que es doble cadena. La polimerasa, para poder copiar, necesita que esas cadenas estén abiertas, para que se peguen los primers y a partir de ahí copia la secuencia que continúa. Para poder abrir las cadenas de ADN se necesita subir la temperatura, porque termodinámicamente se vuelve la unión inestable y se abren esas cadenas, la polimerasa se puede meter en el medio y copiarla. Es como un cierre relámpago. Si está cerrado no se puede enganchar con otras prendas. En cambio, una vez que se abre, se podría concatenar una parte del cierre con otro cierre y la segunda parte del cierre con otro más. Entonces, se tiene que subir la temperatura para que se abran las cadenas de ADN, después se tiene que bajar un poco la temperatura para que esos primers específicos, esas secuencias cortitas específicas que sirven de cebador para la polimerasa puedan pegarse, y después se sube un poco la temperatura para que la polimerasa actúe en su temperatura óptima. Entonces, ahí se va a la polimerasa y de una copia de ADN se pasa a tener dos. Luego se vuelve a hacer el mismo ciclo: se sube la temperatura, se baja y se sube un poquito para de ésas dos tener cuatro. Y Así. Por eso se necesita ese aparato. En este caso de las PCR real time, además, se necesita que ese aparato tenga un lector de fluorescencia con distintos filtros porque después de cada ciclo se tiene una señal fluorescente que es proporcional a la cantidad de cadenas de ADN que se tienen sintetizadas. Se va leyendo en tiempo real, cuando se tienen más cadenas, hay más señal fluorescente. Es un aparato costoso justamente porque tiene esta capacidad de hacer estos ciclos súper rápidos, además de leer con distintas longitudes de onda las distintas señales. La reacción lleva aproximadamente tres horas, más todo lo que es la manipulación y cargado de muestra previa, y después la interpretación de los resultados, que también lleva su tiempo. Hoy en día, cuando un paciente se hace una PCR, en situaciones óptimas, llega la persona, se toma la muestra, se hace el proceso de extracción, después la PCR. Son mínimo ocho horas. Si se aplica el NEOKIT, llega la persona, se toma la muestra y se hace el NEOKIT. Son dos horas. Es una diferencia súper sustancial. 

La LAMP funciona de otro modo porque la polimerasa, que es la que te copia las cadenas, además de polimerasa tiene otra función que se llama helicasa. Eso es que tiene la capacidad de abrir las cadenas de ADN, como desenredarlas. Entonces, no se necesitan esos cambios de temperatura para termodinámicamente abrirlas, sino que la propia enzima se encarga de abrir las cadenas y hace la copia. Se tiene que poner la temperatura óptima de la enzima y ésta se encarga de todo. Para eso, se tiene que hacer un diseño de primers, esos anzuelitos, que es bastante más complejo para que la reacción funcione de determinada manera. Es mucho más rápida y sólo se necesita un dispositivo térmico sencillo.

-A partir de esta técnica AMI, comentabas que han desarrollado una plataforma.

-Basándonos en esta técnica, lo planteamos en términos de plataforma porque adaptamos los distintos pasos. Yo puedo aplicar esta técnica, que es súper sensible y súper específica. Para que sea lo más fácil posible de aplicar, para que estos kits puedan aplicarse en condiciones en campo o points of care (puntos de cuidado), donde está la necesidad y no que haya que hacer un traslado. Lo simplificamos así: adaptamos la toma de muestra según el patógeno que es y en qué lugar se encuentra, adaptamos la reacción de LAMP cambiando un poco el pH, la composición o lo que fuera, y después trabajamos también en la adaptación de la lectura para hacerla simplificada. En términos de plataforma, podemos decidir detectar Chagas congénito en sangre de bebé. Entonces, la muestra la tengo que adaptar de esta manera. Podemos decidir detectar COVID-19. La muestra es hisopado o saliva, la tengo que adaptar de esta otra manera. Como viene de una manera u otra se tienen que ajustar las condiciones de pH, sales, etc., para que funcione bien y después de acuerdo a eso cómo la leo, si por color, por turbidez, etc. Por eso está en términos de plataforma replicable para distintos patógenos (Chagas, dengue, COVID-19, sífilis). 

Es un test de base molecular sensible, rápido y económico que detecta el SARS-CoV-2 en muestras de ARN. Foto: MINCYT.

-En líneas generales, ¿esta técnica se usa para la detección de virus en el mundo?

-Para virus en general, sí. Se usa. Hay varios ejemplos. Y para COVID-19, hay sólo un caso que es de los propios japoneses que desarrollaron la reacción, que es de uso directo y se lee por turbidez. Entonces, recomiendan leer por turbidimetría, con un aparatito. Y después hay otros dos de ese fundamento, pero que vienen como con un aparato propio y exigen un costo mayor porque hacen toda la reacción dentro del propio aparato, donde se pone la muestra, se procesa, etc.

 -¿Qué tipo de uso permite el NEOKIT-COVID-19? ¿Cuál es el objetivo en cuanto a la producción de estos tests? 

-Respecto al uso, el objetivo es que al estar simplificado, se pueda descentralizar. Que no se necesite una máquina de PCR que sale más de 80 mil dólares para poder instalar un punto de diagnóstico. Respecto a la producción, en pocos días vamos a tener la primera producción de 10 mil reacciones y, a partir de ahí, esperamos poder empezar a producir con frecuencia alrededor de 200 mil reacciones al mes.

-Contás con una diplomatura en Comunicación Científica, Médica y Ambiental. ¿Qué importancia considerás que tiene la divulgación de actividades e investigaciones científicas y que los y las protagonistas de la ciencia comuniquen los avances y trabajos que se realizan?

-Creo profundamente en la comunicación de las ciencias. Primero porque quienes hacemos ciencia y tecnología, sobre todo en el sistema público, tenemos el compromiso de compartir nuestras producciones de conocimiento o físicas con la sociedad. También, me parece que tiene un impacto cultural o educativo en la sociedad que hace que la propia sociedad esté más formada, entienda mejor y pueda evaluar mejor el rol de la ciencia y la tecnología. Y además como un rol educativo. Si tenemos un pueblo más educado, tenemos un pueblo más independiente, más soberano, más preparado para los desafíos que vengan. A mí me apasiona la comunicación. Además de hacer biología molecular básica en Chagas y hacer esta parte de investigación y desarrollo de kit, integro un grupo que se llama “¿De qué hablamos cuando hablamos de Chagas?”, en el que justamente trabajamos desde una mirada multidimensional, sumando todas la voces, no solamente las académicas, sino todas las voces porque los problemas complejos tienen que ser abordados con la complejidad de actores y actoras, sino te quedás sin terminar de solucionarlos.

Foto principal: ICT MILSTEIN.

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